• 生物活性
  Torin 1 是一种有效的 mTOR 抑制剂，IC50 为 3 nM。Torin 1 抑制 mTORC1/2 复合物，IC50 值在 2 和 10 nM 之间。

靶点及简介 ：MTOR inhibitor,potent and selective

体外研究：

Torin1（250 nM）完全抑制增殖并导致G1 / S细胞周期停滞，并且在野生型MEF中比50nM雷帕霉素更大程度地降低细胞大小[1]。 Torin1在mTOR和PI3Kis之间的选择性超过800倍，并且相对于其他PIKK家族激酶具有非常高的选择性，但DNA-PK除外[2]。

体内研究：

Torin1（250 nM）完全抑制增殖并导致G1 / S细胞周期停滞，并且在野生型MEF中比50nM雷帕霉素更大程度地降低细胞大小[1]。 Torin1在mTOR和PI3Kis之间的选择性超过800倍，并且相对于其他PIKK家族激酶具有非常高的选择性，但DNA-PK除外[2]。

激酶实验

为了产生可溶性mTORC1，产生HEK-293T细胞系，其使用水疱性口炎病毒G-假型MSCV逆转录病毒稳定表达N末端FLAG标记的Raptor。对于mTORC2，产生HeLa细胞，其稳定表达N末端FLAG标记的Protor-1。通过在50mM HEPES，pH7.4,10mM焦磷酸钠，10mMβ-甘油磷酸钠，100mM NaCl，2mM EDTA，0.3％CHAPS中裂解细胞来纯化两种复合物。将细胞在4℃下裂解30分钟，并通过在13,000rpm下微量离心10分钟除去不溶性级分。将上清液与FLAG-M2单克隆抗体 - 琼脂糖一起温育1小时，然后用裂解缓冲液洗涤三次，用含有终浓度0.5mol / L NaCl的裂解缓冲液洗涤一次。用50mM HEPES，pH 7.4,100mM NaCl中的100μg/ mL 3×FLAG肽洗脱纯化的mTORC1。可以将洗脱液等分并储存在-80℃。激酶测定在30°C下进行20分钟，最终体积为20μL，由激酶缓冲液（25 mM HEPES，pH 7.4,50 mM KCl，10 mM MgCl2,500μMATP）和150 ng无活性S6K1组成或Akt1作为底物。加入80μL样品缓冲液终止反应，煮沸5分钟。随后通过SDS-PAGE和免疫印迹分析样品。

细胞实验

在第0天，将96孔板接种每孔500个细胞并生长过夜。在第1天，用合适的化合物处理细胞，随后在第3-5天进行分析。为了分析，将板在室温下孵育60分钟;向每个孔中加入50μLCellTiter-Glo试剂，并将平板在轨道振荡器上混合12分钟。在标准板发光计上量化发光。

动物实验

对于药效学实验，首先将torin 1粉末以25mg / mL溶解在100％N-甲基-2-吡咯烷酮中，然后在注射前用无菌50％PEG400以1：4稀释。在药物治疗之前，将6周龄雄性C57BL / 6小鼠禁食过夜。通过IP注射用载体（10小时）或26小鼠（20mg / kg，2小时，6小时或10小时）处理小鼠，然后在处死前1小时再处理（CO 2窒息）。收集组织并在干冰上冷冻。将冷冻组织在冰上解冻，并在组织裂解缓冲液（50mM HEPES，pH 7.4,40mM NaCl，2mM EDTA，1.5mM原钒酸钠，50mM氟化钠，10mM焦磷酸钠，10mM钠β）中超声处理裂解。 - 甘油磷酸盐，0.1％SDS，1.0％脱氧胆酸钠和1.0％Triton，补充有蛋白酶抑制剂混合物片剂）。使用Bradford测定法测量澄清裂解物的浓度，随后通过蛋白质含量标准化样品并通过SDS-PAGE和免疫印迹分析。

• 验证及参考文献
  [1]. Thoreen CC, et al, An ATP-competitive mammalian target of rapamycin inhibitor reveals rapamycin-resistant functions of mTORC1. J Biol Chem, 2009, 284(12), 8023-8032.

  [2]. Liu Q, et al. Discovery of 1-(4-(4-propionylpiperazin-1-yl)-3-(trifluoromethyl)phenyl)-9-(quinolin-3-yl)benzo[h][1,6]naphthyridin-2(1H)-one as a highly potent, selective mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibitor for the treatment of cancer. J Med Chem. 2010 Oct 14;53(19):7146-55.

  [3]. Bi C, et al. Inhibition of 4EBP phosphorylation mediates the cytotoxic effect of mechanistic target of rapamycin kinase inhibitors in aggressive B-cell lymphomas. Haematologica. 2017 Apr;102(4):755-764.

  [4]. Brandt M, et al. mTORC1 Inactivation Promotes Colitis-Induced Colorectal Cancer but Protects from APC Loss-Dependent Tumorigenesis. Cell Metab. 2018 Jan 9;27(1):118-135.e8.

• 溶解度及制备方案
  

  Concentration / Solvent Volume / Mass	1 mg	5 mg	10 mg
  1 mM	1.65 mL	8.23 mL	16.46 mL
  5 mM	0.33 mL	1.65 mL	3.29 mL
  10 mM	0.16 mL	0.82 mL	1.65 mL
  50 mM	0.03 mL	0.16 mL	0.33 mL