• 生物活性

靶点及简介 ：UCH-L1 inhibitor,reversible competitve

一种可逆的竞争性的蛋白酶体抑制剂，抑制Uch-L1时，IC50为0.88 μM，比作用于亚型Uch-L3选择性高30倍。

LDN-57444是一种可逆的竞争性的蛋白酶体抑制剂，，抑制UCch-L1时，IC50为0.88 μM，比作用于亚型Uch-L3选择性高30倍。50 μM LDN-57444处理24小时，抑制70% 蛋白酶活性。25 μM 以上的LDN-57444显著降低细胞存活率，这种作用存在浓度依赖性，50 μM 时，细胞存活率降低至61.81％。LDN-57444通过细胞凋亡途径能够导致细胞死亡，通过降低泛素蛋白酶体系统的活性，并增加高度泛素化蛋白的水平，这两者都可以激活未折叠的蛋白反应。

体外研究

    LDN-57444是UCH-L1的可逆竞争性抑制剂，IC50为0.88μM，并且还抑制UCH-L3活性，IC50为25μM[1]。 LDN-57444（LDN，5μM，1小时）抑制小鼠脑海马切片中70％的Uch活性。 LDN-57444（5μM，2小时）不会进一步降低APP / PS1切片或暴露于200nMAβ的wt切片中的增强作用[2]。 LDN-57444（25-100μM）在SK-N-SH细胞中剂量依赖性

地抑制遍在蛋白 - 蛋白酶体活性。 LDN-57444（50μM）也诱导凋亡细胞死亡，引起内质网应激并导致SK-N-SH细胞中剪接的XBP-1（XBP-1s，48KD）的表达[3]。

体内研究

    LDN-57444（0.4 mg / kg，ip）阻断了V-Uch-L1的有益作用，并且在训练后第1,7,14和21天小鼠暴露于上下文时恶化了背景调节性能[2] 。

激酶实验

    为了开始测定，将0.5μL的5mg / mL测试化合物（包括LDN-57444，约50μM最终反应浓度）或DMSO对照等分到每个孔中。酶和底物均在UCH反应缓冲液（50mM Tris-HCl [pH 7.6]，0.5mM EDTA，5mM DTT和0.5mg / mL卵清蛋白）中制备。然后向每个孔中加入25μL的0.6nM UCH-L1，除了底物对照孔，然后在自动振荡器上摇板45-60秒。将酶/化合物混合物在室温下孵育30分钟，然后加入25μL的200nM Ub-AMC以引发酶反应。将反应混合物（300μMUCH-L1,100nM泛素-AMC与2.5μg测试化合物）在室温下再孵育30分钟，然后通过每孔加入10μL500mM乙酸淬灭反应。使用香豆素滤光片组（ex = 365nm，em = 450nm）在LJL Analyst上测量荧光发射强度，并通过内在化合物荧光减去荧光发射强度以显示酶活性。 DMSO对照（0.5μLDMSO，25μLUCH-L1,25μL泛素-AMC，10μL乙酸），酶对照（25μLUCH-L1,25μL缓冲液，10μL乙酸） ），底物对照（25μL缓冲液，25μL泛素-AMC，10μL乙酸）和抑制剂对照（0.5μL泛素醛[100 nM原液]，25μLUCH-L1,25μL泛素）在每个测定板中也进行-AMC，10μL乙酸）以确保质量和再现性。使用相同的方案手动重复UCH-L1酶促反应两次以确认来自主要机器人辅助筛选的命中化合物的结果[1]。

细胞实验

    通过MTT的定量比色测定法测量细胞活力。药物处理后，将SK-N-SH细胞与5g / L MTT一起温育4小时，然后加入DMSO 15分钟。使用微量板读数器在570nm处量化吸收[3]。

动物实验

    将每只动物单独放入调节室中。电流逐渐增加（0.1mA，1秒，30秒间隔，使冲击强度增加0.1mA至0.7mA）。评估动物行为对休克（退缩）的第一次可见反应，第一次极端运动反应（跑/跳）和第一次发声窘迫（尖叫）。通过平均每种动物表现出该类型对足部休克的行为反应的冲击强度，对每只动物量化退缩，跳跃和尖叫的阈值。视觉，运动和动力技能也通过可视平台训练进行测试，测量时间和速度，以达到放置在充满水的池中的可见平台。通过视频跟踪系统记录和分析到达平台和游泳速度的时间。在LDN-57444（LDN）和TAT融合蛋白存在下测试恐惧条件反射的实验中，在不同组的小鼠中没有观察到差异。为了确定LDN-57444的给药时间，进行了一系列初步实验，其中抑制剂以不同的间隔（4小时前，1小时前，1小时后和4小时后）从电中腹膜内注射。休克。在训练阶段，LDN-57444或载体注射小鼠的冷冻没有差异[2]。

• 验证及参考文献

验证：

参考文献：

[1]. Liu Y, et al. Discovery of inhibitors that elucidate the role of UCH-L1 activity in the H1299 lung cancer cell line. Chem Biol. 2003 Sep;10(9):837-46.

[2]. Gong B, et al. Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory. Cell. 2006 Aug 25;126(4):775-88.

[3]. Tan YY, et al. Endoplasmic reticulum stress contributes to the cell death induced by UCH-L1 inhibitor. Mol Cell Biochem. 2008 Nov;318(1-2):109-15.

• 溶解度及制备方案

DMSO	11 mg/mL   (27.66 mM)
Water	Insoluble
Ethanol	Insoluble

• 制备储备液

浓度   溶剂体积    质量	1 mg	5 mg	10 mg
1 mM	2.5148 mL	12.5742 mL	25.1484 mL
5 mM	0.5030 mL	2.5148 mL	5.0297 mL
10 mM	0.2515 mL	1.2574 mL	2.5148 mL



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