• 生物活性

靶点及简介 ：BRAF kinase inhibitor

一种有效的，选择性的B-Raf^V600E抑制剂，无细胞试验中IC50为13 nM，同样有效地作用于c-Raf-1(Y340D和Y341D突变型)，作用于B-RafV600E比作用于野生型B-Raf选择性高10倍。

体外研究：

    PLX-4720对野生型B-Raf的选择性> 10倍，对其他激酶如Frk，Src，Fak，FGFR和Aurora A的选择性> 100倍，IC50为1.3-3.4μM。 PLX-4720显着抑制携带B-RafV600E的细胞系中的ERK磷酸化，IC50为14-46nM，而不是野生型B-Raf的细胞。 PLX-4720显着抑制携带B-RafV600E致癌基因的肿瘤细胞系的生长，例如COLO205，A375，WM2664和COLO829，GI50分别为0.31μM，0.50μM，1.5μM和1.7μM。此外，1μM的PLX-4720处理仅在B-RafV600E阳性1205Lu细胞中诱导细胞周期停滞和凋亡，但在B-Raf野生型C8161细胞中不诱导[1]。与PTEN-细胞系相比，PLX-4720处理（10μM）显着诱导PTEN +细胞中BIM的> 14倍表达（4倍），解释了PTEN-细胞对PLX-4720-的抗性。诱导细胞凋亡[2]。

体内研究

    以20mg / kg /天口服施用PLX-4720在B-RafV600E依赖性COLO205肿瘤异种移植物中诱导显着的肿瘤生长延迟和消退，即使在1g / kg的剂量下也没有明显的小鼠副作用。每天两次100mg / kg的PLX-4720几乎完全消除了携带B-RafV600E的1205Lu异种移植物，而对携带野生型B-Raf的C8161异种移植物没有活性。 PLX-4720的抗肿瘤作用与那些携带V600E突变的细胞中MAPK通路的阻断相关[1]。 PLX-4720以30mg / kg /天的剂量显着抑制8505c异种移植物的肿瘤生长> 90％，并显着降低远处肺转移[3]。

激酶实验

    对于每种酶（0.1ng），在20mM Hepes（pH 7.0），10mM MgCl 2,1mM DTT，0.01％Tween-20,100nM生物素-MEK蛋白，各种ATP浓度，和在室温下增加PLX-4720的浓度。用5μL含有20mM Hepes（pH 7.0），200mM NaCl，80mM EDTA和0.3％BSA的溶液在2,5,8,10,20和30分钟停止反应。终止溶液还包括来自AlphaScreen蛋白A检测试剂盒的磷酸-MEK抗体，链霉抗生物素蛋白包被的供体珠和蛋白A受体珠。将抗体和珠子在室温下在黑暗中在终止溶液中预孵育30分钟。抗体的最终稀释度为1 / 2,000，每个珠子的最终浓度为10μg/ mL。将测定板在室温下温育1小时，然后在PerkinElmer AlphaQuest读数器上读数。

细胞实验

    用各种浓度的PLX-4720处理细胞24,48和72小时。通过使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定或MTT测定来测量细胞增殖。对于细胞周期分析，收集上清液和细胞，沉淀并用70％乙醇固定。在用碘化丙锭（10μg/ mL）染色之前，将细胞在37℃下在0.5mg / mL RNase I中温育1小时，以除去残留RNA污染的样品。然后使用EPICS XL装置分析样品。为了评估细胞凋亡，在用膜联蛋白-FITC和碘化丙锭染色之前收获培养基和细胞并沉淀。随后使用EPICS XL装置分析样品。

动物实验

    将转移性黑素瘤细胞（2×10 6）皮下注射到SCID小鼠的侧腹中，并允许2周达到0.125mm 3的体积。随后，动物每天两次接受100mg / kg PLX4720（口服强饲法）或载体对照，持续15天。每72小时记录肿瘤体积。将每个相应组的平均肿瘤大小标准化为治疗第一天的肿瘤体积。处理15天后，杀死动物并切除肿瘤，用福尔马林固定，石蜡包埋，并通过免疫组织化学分析。

• 验证及参考文献

验证：

参考文献：

[1]. Tsai J, et al. Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(8), 3041-3046.

[2]. Paraiso KH, et al. PTEN loss confers BRAF inhibitor resistance to melanoma cells through the suppression of BIM expression. Cancer Res, 2011, 71(7), 2750-2760.

[3]. Nucera C, et al. B-Raf(V600E) and thrombospondin-1 promote thyroid cancer progression. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107(23), 10649-10654.

[4]. Rizzolio S, et al. Neuropilin-1 upregulation elicits adaptive resistance to oncogene-targeted therapies. J Clin Invest. 2018 Aug 31;128(9):3976-3990

• 溶解度及制备方案

DMSO	83 mg/mL  (200.57 mM)
Water	Insoluble
Ethanol	Insoluble

• 制备储备液

浓度   溶剂体积     质量	1 mg	5 mg	10 mg
1 mM	2.4165 mL	12.0823 mL	24.1645 mL
5 mM	0.4833 mL	2.4165 mL	4.8329 mL
10 mM	0.2416 mL	1.2082 mL	2.4165 mL
50 mM	0.0483 mL	0.2416 mL	0.4833 mL

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