• 生物活性

靶点及简介 ：

Omipalisib (GSK2126458) 是一种高选择性，有效的 PI3K 抑制剂，抑制 p110α/β/δ/γ，mTORC1/2 的活性，Ki 值分别为 0.019 nM/0.13 nM/0.024 nM/0.06 nM 和 0.18 nM/0.3 nM。Omipalisib 可诱导自噬。Phase 1。

体外研究：

    Omipalisib（GSK2126458）有效抑制人癌症中发现的p110α（E542K，E545K和H1047R）的常见活化突变体的活性，Ki分别为8 pM，8 pM和9 pM。 Omipalisib导致pAkt-S473水平显着降低，在T47D和BT474细胞中具有显着效力，IC50分别为0.41 nM和0.18 nM。此外，Omipalisib（GSK2126458）导致G1细胞周期停滞并在大量细胞系中产生抑制作用，包括T47D和BT474乳腺癌细胞系，IC50分别为3 nM和2.4 nM [1]。 Omipalisib或GSK1120212与Omipalisib的组合可增强细胞生长抑制，并减少来自A375 BRAF（V600E）和YUSIT1 BRAF（V600K）黑色素瘤细胞系的耐药性克隆中的S6核糖体蛋白磷酸化[2]。 Omipalisib（GSK2126458）可增强DDR1-IN-1在结直肠癌细胞系中的抗增殖活性[3]。

体内研究：

    在BT474人肿瘤异种移植模型中，Omipalisib（GSK2126458）处理导致pAkt-S473水平的剂量依赖性降低，并且在300μg/ kg的低剂量下表现出剂量依赖性肿瘤生长抑制。此外，Omipalisib（GSK2126458）在四种临床前物种（小鼠，大鼠，狗和猴子）中显示出低血液清除率和良好的口服生物利用度[1]。

细胞实验：

Cell lines: BT474, HCC1954 和 T-47D    Concentrations: 0 到 1 μM   Incubation Time: 72 小时 [1]

Method: BT474, HCC1954 和 T-47D(人类乳腺)培养在含10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养基中，培养在37oC下含 5% CO2的 孵育器中。在实验前2到3天，细胞按密度分到T75 烧瓶中，这样在实验收集时获得约70-80% 细胞汇合。使用0.25% 胰蛋白酶-EDTA收集细胞。在细胞悬液中使用台酚蓝染色排除染色，进行细胞计数。细胞按每孔1000个细胞接种在384孔黑色平底聚苯乙烯板中， 每孔含48 μL 培养基。所有实验板置于5% CO2, 37oC 下过夜，第二天加入 GSK2126458。使用CellTiter-Glo处理一个实验板，用于第一天测量。GSK2126458 在清澈见底的聚丙烯384孔板中制备，连续稀释两倍。4 μL 这些稀释液加到105 μL 培养基中混合溶液后, 细胞板的每孔中加入2 μL这些稀释液。所有孔中的 DMSO 终浓度为0.15%。细胞在37oC, 5% CO2 环境中温育 72小时。随后与 GSK2126458温育72小时。CellTiter-Glo试剂加到实验板中，使用与孔中细胞培养体积相当量的体积。震荡实验板约2分钟，在室温下温育约30分钟，然后在Analyst GT 读数器上读取化学分光信号。

激酶实验：

[1]体外均相时间分辨荧光技术（HTRF）测定 PI3K 抑制:

在384孔聚丙烯母板上，化合物 (3倍溶于100% DMSO) 从1列到12列，和13列到24列连续稀释，获得11种浓度 GSK2126458。6列和18列只含DMSO。滴定后，0.05μL 立即转移到384孔低容量实验板上。 实验板中含3种药物对照(PI3K 抑制剂)和3组实验对照: (1) 不含抑制剂的酶实验;(2) 去酶buffer, 和 (3)去酶加 PIP3的buffer。DMSO加到6列和18列的所有孔中。40 μM PIP3加到 1X 反应 buffer (1μL 200 μM PIP3)中， 交替 18列的行数 ( B, D, F, H, J, L, N, P)。不含酶的对照实验在 A, C, E, G, I, K, M, O孔中 (0.1μL 100% DMSO)中进行。使用 HTRF试剂盒优化PI3K 实验 。实验试剂盒中含7种试剂: 1) 4X 反应Buffer; 2) PIP2 (底物); 3) Stop A (EDTA); 4) Stop B (生物素-PIP3); 5) 检测混合物A (链霉亲和素-APC); 6)检测混合物 B (Eu-标记的抗-GST抗体和 GST标记的 PH域); 7) 检测混合物 C (KF)。通过使用去离子水按1:4稀释而制备PI3K反应 Buffer。加入新鲜制备的 DTT，终浓度为5 mM。加入酶，使用Multidrop Combi 在1X反应 buffer中加入2.5μL PI3K，加到每孔中 ，开始预温育化合物。实验板在室温下温育15分钟。 使用Multidrop Combi，加入 2.5μL 2X底物溶液(PIP2和 ATP，溶于 1X 反应buffer)开始反应。实验板在室温下温育1小时。 使用Multidrop Combi在所有孔中加入2.5μL 终止液 (Stop A和 Stop B按5:1比例预混合)，反应淬灭。使用Mulitdrop Combi(检测混合物 C, 检测混合物 A,和检测混合物 B 按18:1:1比率混合，即: 6000 μL 总体积, 混合 5400 μL 检测混合物 C, 300μL 检测混合物 A, 和 300 μL 检测混合物 B)在所有孔中加入2.5μL 检测液，进行淬火反应，检测形成的产品。备注:这种溶液在使用前2小时制备。在暗中温育1小时后，在Envision 酶标仪上测量HTRF信号，在330nm 处测定激发光，在620nm (Eu) 和665nm (APC)处双重发射光。

动物实验：Animal Models: 在小鼠体内移植BT474肿瘤    Dosages: ≤300 μg /kg    Administration: 口服处理[1]

• 验证及参考文献

验证：

参考文献：

[1]. Knight SD, et al. Discovery of GSK2126458, a Highly Potent Inhibitor of PI3K and the Mammalian Target of Rapamycin. ACS Med. Chem. Lett. 2010, 1 (1), 39-43.

[2]. Greger JG, et al. Combinations of BRAF, MEK, and PI3K/mTOR inhibitors overcome acquired resistance to the BRAF inhibitor GSK2118436 dabrafenib, mediated by NRAS or MEK mutations. Mol Cancer Ther. 2012 Apr;11(4):909-20.

[3]. Kim HG, et al. Discovery of a potent and selective DDR1 receptor tyrosine kinase inhibitor. ACS Chem Biol. 2013 Oct 18;8(10):2145-50.

• 溶解度及制备方案
  

DMSO	101 mg/mL    (199.80 mM)
Water	Insoluble
Ethanol	Insoluble

制备储备液

Concentration / Solvent Volume / Mass	1 mg	5 mg	10 mg
1 mM	1.98 mL	9.89 mL	19.78 mL
5 mM	0.40 mL	1.98 mL	3.96 mL
10 mM	0.20 mL	0.99 mL	1.98 mL
50 mM	0.04 mL	0.20 mL	0.40 mL

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