• 生物活性

靶点及简介 ：GSK3β inhibitor, ATP-competitive and selective

AR-A014418是ATP竞争性和选择性的GSK3β抑制剂,IC50和K_i为104 nM和38 nM,而对被测试的其他26种激酶没有显著抑制作用。

体外研究

    AR-A014418阻断表达人四重复tau蛋白的3T3成纤维细胞中GSK3特异性位点（Ser-396）的tau磷酸化，IC50为2.7μM，并保护培养的N2A细胞免受PI3K / PKB途径诱导的死亡堵塞。 AR-A014418还显示海马切片中β-淀粉样肽介导的神经变性的抑制作用[1]。 AR-A014418降低神经内分泌标志物并抑制NGP和SH-5Y-SY细胞中神经母细胞瘤细胞的生长[2]。

体内研究

    AR-A014418（0-4 mg / kg，ip）延迟症状的发作，增强运动活动，阻止疾病进展，并在具有G93A突变型人SOD1的ALS小鼠模型中推断该疾病的终点[3]。此外，AR-A014418通过调节NMDA和代谢型受体信号以及脊髓中TNF-α和IL-1β的传递来抑制乙酸和福尔马林诱导的小鼠伤害感受[4]。

激酶实验

    在透明底微量滴定板中用10种浓度的抑制剂一式两份进行竞争实验。生物素化的肽底物，生物素-AEAELDSRAGS（PO3H2）PQL，在含有6毫单位重组人GSK3（α和β的相同混合物），12mM MOPS，pH7.0的测定缓冲液中以2μM的终浓度加入， 0.3mM EDTA，0.01％β-巯基乙醇，0.004％Brij 35,0.5％甘油和0.5μg牛血清白蛋白/25μL并预孵育10-15分钟。通过在50mM Mg（Ac）2中加入0.04μCi[γ-33P] ATP和未标记的ATP至终浓度为1μMATP并且测定体积为25μL来引发反应。使用不含肽底物的空白对照。在室温下孵育20分钟后，通过加入25μL含有5mM EDTA，50μMATP，0.1％Triton X-100和0.25mg链霉抗生物素蛋白包被的SPA珠子的终止溶液终止每个反应。 35 pmol的结合力。 6小时后，在液体闪烁计数器中测定放射性。使用GraphPad Prism通过非线性回归分析抑制曲线。

细胞实验

    通过钙黄绿素/碘化丙锭摄取评估细胞活力。钙黄绿素AM被活细胞中存在的酯酶吸收并裂解，产生黄绿色荧光，而PI仅被死细胞吸收，后者变成橙红色荧光。简言之，将N2A细胞在体外培养2天，然后在AR-A014418或载体（DMSO）存在下用50μMLY-294002处理24小时。随后，将N2A细胞与2μMPI和1μM钙黄绿素-AM一起温育30分钟。然后用含有2mM CaCl 2的Hanks缓冲盐水溶液冲洗培养物三次，并使用Zeiss Axiovert 135显微镜通过荧光显微镜观察细胞。在至少三个不同的实验中，每孔（appr 300细胞/场）分析三个视野（随机选择）。细胞死亡表示为PI阳性细胞占细胞总数的百分比。在每个实验中，在减去载体处理的培养物中存在的死细胞的数量后获得特异性细胞死亡。

动物实验

    首先，为了检查GSK-3抑制对ALS的临床症状，寿命和运动行为功能的影响，将56只Tg小鼠分成四组。在每组中，将0.5mL生理盐水与每克小鼠0μg（对照组），1μg（组A），2μg（组B）或4μg（组C）AR-A014418混合，并且从出生后60天开始，每周5天，每组14只动物腹膜内注射。在下述终点处死小鼠。

• 验证及参考文献

验证：

参考文献：

[1]. Bhat R, Xue Y, Berg S, Structural insights and biological effects of glycogen synthase kinase 3-specific inhibitor AR-A014418. J Biol Chem. 2003 Nov 14;278(46):45937-45.

[2]. Carter YM, et al. Specific glycogen synthase kinase-3 inhibition reduces neuroendocrine markers and suppresses neuroblastoma cell growth. Cancer Biol Ther. 2014 May;15(5):510-5.

[3]. Koh SH, et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 suppresses the onset of symptoms and disease progression of G93A-SOD1 mouse model of ALS. Exp Neurol. 2007 Jun;205(2):336-46

[4]. Martins DF, et al. The antinociceptive effects of AR-A014418, a selective inhibitor of glycogen synthase kinase-3 beta, in mice. J Pain. 2011 Mar;12(3):315-22.

• 溶解度及制备方案

DMSO	61 mg/mL (197.85 mM)
Water	Insoluble
Ethanol	Insoluble

制备储备液

浓度 溶剂体积  质量	1 mg	5 mg	10 mg
1 mM	3.2435 mL	16.2174 mL	32.4349 mL
5 mM	0.6487 mL	3.2435 mL	6.4870 mL
10 mM	0.3243 mL	1.6217 mL	3.2435 mL
50 mM	0.0649 mL	0.3243 mL	0.6487 mL



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